超凈工作臺在纖維細胞生物學實驗的使用

近年來，隨著組織工程及再生醫(yī)學的迅猛進展脂肪干細胞鑒于其取卡材便利，來源豐富，低免疫性及多分化潛能等諸多優(yōu)點，已成為人們研究的熱門。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潛能在組織工程和再生醫(yī)學中的應用，很少關照ADSCs分泌功能在組織損傷修復中的作用。本實驗通過使用超凈工作臺并觀測研究了ADSCs分泌功能對成纖維細胞的生物學影響，探討ADSCs分泌功能促創(chuàng)面愈合的機制。

材料和方法

1 主要儀器與試劑：DMEM培養(yǎng)液、胰酶、I型膠原酶、二甲基亞砜、MTT、小牛血清，胎牛血清，annexinV凋亡檢測試劑盒，Mondel680型酶標儀，垂直流超凈工作臺，CO2細胞培養(yǎng)箱，顛倒顯微鏡，流式細胞儀。

2 ADSCs分離與培養(yǎng)：取腹部外科手術患者皮下脂肪組織約59，無菌條件下用剪刀剔除血管及其它組織碎片，用含雙抗的PBS液反復浸泡沖洗3次，每次約5min，用眼科剪將脂肪組織剪成約lmm3的碎塊，置于0．1％的I型膠原酶中于37℃水浴振蕩消化1h；加入等體積l0％胎牛血清精細消化后，用200目的細胞篩網過濾，600g離心lOmin，棄去上層脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培養(yǎng)液重懸接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％的C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。2天后換液，細胞長滿80％時傳代培養(yǎng)。

3 3ADSCs培養(yǎng)上清液的制備：選擇生長良好第3代．ADSCs細胞接種于75cm2的培養(yǎng)瓶，生長至80％融合時，換成尢血清培養(yǎng)液DMEM15ml，培養(yǎng)3天后，搜集上清液。上清液經O．22μm的濾膜過濾．分裝，一80。C凍存?zhèn)溆谩?/p>

4 人皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)：用組織塊法培養(yǎng)原代細胞，置于10％小牛血清培養(yǎng)液中，置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中陳規(guī)培養(yǎng)。

5 成纖維細胞增殖的測定：采納MTT法測定。傳代時取第3代成纖維細胞以3×10／孔接種于12孔板，陳規(guī)培養(yǎng)24h后棄上清，設實驗組及對比組，實驗組均用ADSC-CM及2％小牛血清配制，對比組僅用2％小牛血清培養(yǎng)液，每組設3個復孔。各組加對應的培養(yǎng)液lml，連續(xù)培養(yǎng)3天后，每孔分別加入5g／L的MTT100μl，37℃、5％C02孵育4h后，精細培養(yǎng)：吸棄上清液，每孔加入750μl。二甲基亞楓，連續(xù)孵育lOmin后稍微振蕩使紫藍色沉淀融解，然后以150μl／孔移動至96孔板，每孔反復5次。用酶標儀測定490nm波長下的吸光度值。

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